这与SARS-CoV RBD与人类ACE2的结合亲和实验结果一致。与SARS-CoV RBD和人类ACE2界面的接触残基相比，可以观察到ACE2上的两个病毒病毒结合热点(hotspot hotspot Lys31和Lys353分别由Glu35和Asp38组成的盐桥)或附近的变化。如前所述，这两个热点隐藏在疏水环境中。它们为病毒-受体结合相互作用提供了大量的能量，并填补了结合界面上疏水性叠加238相互作用的关键空隙。
与人ACE2相比，中华菊头蝠ACE2-3357的两个主要残留变化是E35K和Y41H。E35K与RsSHC014 RBD中K31和Arg479的盐桥断裂，可能影响它们之间的结合亲和力。41位置的组氨酸可能会削弱K353- d38盐桥的支撑力，因为组氨酸比酪氨酸的疏水性更弱，导致其与BJ01 RBD的结合亲和力降低。因此，BJ01和RsSHC014 RBD与中华菊头蝠ACE2 -3357的结合亲和力较低。
在中华菊头蝠ACE2-1434中，位置31发现了苏氨酸，这与人类ACE2的这个位置不同，人类的是赖氨酸。虽然K31T的变化导致其不能与Glu35形成盐桥，但BJ01的RBD c中的Tyr442可以与之形成氢键。但RsWIV1 RBD中位于442的丝氨酸则不具备这种功能。
此外，RsSHC014含有一个位于479的精氨酸，Thr31不能与Glu35形成盐桥，使Glu35可以与Arg479形成盐桥，但RsWIV1中的RBD残基Asn479可能会导致其失去这一能力。因此，BJ01和RsSHC014 RBD可以与中华菊头蝠ACE2 -1434结合，但RsWIV1RBD无法与中华菊头蝠的ACE2 -1434结合。
本研究中所有的中华菊头蝠 ACE2在82的位置都包含一个天冬酰胺，而人类ACE2在此位置则是蛋氨酸。M82N的变化引入了一个不利的亲水残基，削弱了热点31周围的疏水网络。此外，Asn82引入了一个糖基化位点，就像在大鼠ACE2中一样，导致其不能有效支持SARS-CoV感染;ACE2在82位置上的聚糖可能导致空间干扰病毒RBD结合。
因此，M82N可能对SARS-CoV及SARS相关冠状病毒RBD与中华菊头蝠ACE2s的相互作用有显著影响。如前所述，RBD的487残基与ACE2上的热点353相互作用。RsWIV1 RBD中含有Asn487, Asn487的极性侧链可能与ACE2中Lys353残基的脂肪族部分发生不利的相互作用，影响K353与D38的热点相互作用。
此外，RsSHC014 RBD在位置487含有一个丙氨酸;Ala 487的小侧链不支持热点353的结构。因此，RsWIV1及RsSHC014 RBD与人类ACE2的结合亲和力均低于BJ01，但与人类ACE2的结合亲和力均高于中华菊头蝠ACE2，这与病毒感染和结合实验结果高度相符。
SARSr-CoV刺突基因通过正向选择与中华菊头蝠ACE2共同进化
为了测试作用于SARS病毒刺突蛋白和中华菊头蝠ACE2基因可能存在的选择压力，他们使用PAML软件包的编码ml程序来分析单个密码子的非同义突变与同义突变的比值(dN/dS比值)。通过分析了完整的编码SARS相关冠状病毒刺突蛋白的基因序列，并比对了来自中华菊头蝠样本的9个SARS相关冠状病毒刺突蛋白的基因序列。
研究发现模型允许密码子在正向选择(M2a和M8)下进化。在模型M8(初始种子值ω(dN / dS) = 1.6,密码子频率= F3X4), 20个密码子(p > 0.95)以dN / dS > 1的速率正向选择，根据晶体结构显示，298个密码子中有17个被发现位于RBD区域，面向受体ACE2。此外，在SARS-CoV刺突中出现的5个密码子(442、472、479、480和487)，此前已被确定对人类ACE2的结合亲和力有显著影响。
接下来，他们通过比对本研究获得的以及从GenBank下载的25个中华菊头蝠ACE2基因序列，对中华菊头蝠ACE2基因进行分析。他们发现在模型M8中，12个密码子(2.3%,p > 0.95)以dN / dS > 1的速率进行正向选择，其中8个密码子(31、24、27、34、35、38、41、42)对应于人类ACE2的残留物，这些密码子直接参与人类SARS病毒刺突蛋白的接触。
他们还分析了中菊头蝠(R. affinis)的ACE2基因，有报道称该基因偶尔也能结合SARS相关冠状病毒。利用本研究获得的23个来自中菊头蝠的ACE2基因序列比对，发现中菊头蝠ACE2在整个编码区不同个体间的保守性比中华菊头蝠ACE2更强，并且没有观察到明显的正向选择位点(数据未显示)。
此外，通过查询单核苷酸多态性(SNP)数据库，他们发现人类ACE2基因中的SNPs在整个编码区域随机产生。虽然在人类ACE2中发现了两个具有非同义突变(T27A和E35K)的SNP位点，但它们在全球人群中都显示出罕见的频率(频率分别为0.00001和0.00002)。这些结果表明，在蝙蝠SARS相关冠状病毒刺突蛋白与中华菊头蝠ACE2的交界面发生了正向选择。
